肠道微生物群落是一个由数万亿细菌、真菌、病毒、古生菌和原生生物组成的多样性微生物群落，其编码的功能基因比人类基因组多几个数量级。肠道微生物群能通过微生物群-肠-脑轴在中枢神经系统（CNS）中发挥重要作用。尽管在正常情况下，人类宿主和肠道微生物群之间的关系是互利的，但肠道微生物群的扰动与许多慢性疾病有关。

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是全球最普遍的疾病之一。高脂肪、高胆固醇（HFHC）饮食可导致早期的NASH模型，此外还会导致肠道微生物组成发生变化，减少微生物多样性和特定细菌分类群的变化。随着时间的推移，NASH可能进展为肝硬化、终末期肝病或需要肝移植。有研究发现肝-肠道微生物群与认知之间存在功能联系，肠道微生物群可通过微生物群-肠道-大脑轴介导饮食的影响，改变宿主大脑的新陈代谢，破坏认知。

近期，西班牙阿斯图里亚斯神经学研究所为代表以通过“评估环境丰富（EE）和灌胃Lacticaseibacillus rhamnosus GG（LGG）或Akkermansia muciniphila CIP107961（AKK）对NASH诱导的认知损伤的影响，来比较它们对微生物群变化、大脑代谢以及最终认知改善的影响，并详细分析了实验结果”。

研究团队将56只雄性Sprague-Dawley大鼠分为七组（每个实验组n = 8）：NC（正常食物）、NC+EE（正常食物+环境丰富）、HFHC（高脂肪、高胆固醇饮食）、HFHC+EE、HFHC+PBS（磷酸盐缓冲盐水）、HFHC+LGG（Lacticaseibacillus rhamnosus GG，ATCC53103）和HFHC+AKK (Akkermansia muciniphila CIP107961)。所有组持续给予饮食14周，每周称重。最终收集每只动物的新鲜粪便颗粒并保存，用于后续16S rRNA基因谱和定量PCR分析，气相色谱法测定粪便上清液中的SCFA和BCFA水平。第12周到第14周对各组小鼠进行认知评估，包括用Rotarod 7750测试运动功能；新物体识别测试；莫里斯水迷宫 (MWM) 测试空间工作记忆。空间工作记忆任务后90分钟收集大脑进行脑代谢活动分析。

1、环境丰富可恢复由HFHC饮食引起的认知缺陷

双向方差分析（组×周）评估体重增加发现，在整个14周的饮食管理期，各组间的体重没有显著差异，只显示出跨周的显著差异。体重的正常增加伴随着各组间没有显著的运动缺陷。新物体识别测试发现NC和NC+EE组能够识别新对象，而HFHC组无法区分物体，但通过提供EE后HFHC+EE组能恢复新物体识别能力，表明HFHC组最初的对象识别障碍因提供EE而发生逆转。空间工作记忆测试发现NC和NC+EE组能够记住平台的位置，而HFHC组无法记住它，但是在提供EE后HFHC+EE组也能记住平台的位置，表明HFHC受损的空间工作记忆被EE改善。

图左 受饮食和EE影响的实验组的时间线、体重和行为评估

图右 探索和鉴别物体的指数

2、环境丰富改善认知

HFHC组的CCO活性值显著低于NC组，并且在边缘下皮层（IL）、扣带回皮层（Cg）、背侧纹状体（dST）、伏隔壳（AcbS）和嗅周皮层（PRh）的代谢活性较少。EE导致NC+EE和HFHC+EE组的CCO水平下降。NC+EE组在前额叶皮层、背侧和腹侧纹状体、丘脑、海马亚区CA3和DG的CCO水平低于NC组。此外，与HFHC组相比，HFHC+EE组小鼠的背侧和腹侧纹状体、前背侧丘脑 （ADT）、基底外侧杏仁核(BLA)、齿状回（DG）和CA3的CCO 值也降低。最后，HFHC+EE在DG区显示出比NC+EE更低的CCO值，但在前额叶皮层、背侧和腹侧纹状体、丘脑、杏仁核和嗅周皮层中HFHC+EE和NC+EE之间没有发现差异。

表左 受NC、HFHC饮食和EE影响的不同组的大脑氧化代谢

图右 受NC、HFHC饮食和EE影响的不同组的肠道微生物探索

3、环境丰富影响菌群组成和细菌代谢

通过计算Chao1（丰富度估计量）和Shannon’s index（丰富度和均匀度估计量）评估EE对群落内微生物多样性的影响，结果发现，与NC组相比，HFHC组中的细菌多样性显著更少，还观察到NC+EE组比NC组的细菌多样性有所增加。然而，EE不影响HFHC+EE组的细菌多样性，该组的细菌多样性显著低于NC+EE组。接下来评估每组大鼠的肠道微生物群组成发现， NC组比HFHC组的Lactobacillaceae和Ruminococacceae的丰度更高，后者Enterobacteriaceae、Bacteroidaceae或Peptostreptococcaceae的丰度更高。应用线性判别分析效应大小 (LEfSe) 方法解释各群体丰度差异的分类，对比NC、NC+EE、HFHC、HFHC+EE四组后发现，与其他三组相比，NC+EE组的Micrococcaceae、Christensenellaceae和Ruminococcaceae的丰度显著增加，HFHC+EE组中差异最大的是Firmicutes phyla和Akkermansiaceae的不同科的微生物丰度增加。分析细菌代谢的主要物质短链脂肪酸（SCFA）和支链脂肪酸(BCFA)发现，与NC组相比，HFHC组中主要的SCFA浓度显著更低，NC+EE和HFHC+EE与其对照组（分别为NC和HFHC）的相比乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐或戊酸盐虽然有下降趋势但差异不明显，BCFAs异丁酸和异戊酸（n.s.）的浓度都较低。

4、Akk的治疗方法可恢复认知缺陷

饮食管理的14周内发现各组的体重跨周具有显著差异，体重的正常增加伴随着各组的运动缺陷的消失。在物体识别测试中，实验组确实在E1上表现出显著差异，其中HFHC+PBS和HFHC+LGG组比NC组需要花费更多时间探索。此外，E2上也存在差异，其中HFHC+LGG组在执行新的物体识别保留/测试试验时比NC组花费更多时间，而D1组之间没有发现差异。NC和HFHC+AKK的D2辨别率显著高于HFHC+PBS和HFHC+LGG。这些结果表明HFHC+PBS表现出一种物体识别障碍，该障碍不能通过LGG治疗恢复，但可被 AKK治疗逆转。评估益生菌对相关前额叶依赖任务（例如空间工作记忆）的功效时发现，HFHC+LGG组和HFHC+PBS组无法执行任务，而HFHC+AKK组与NC组一样正确地执行任务，并且能够记住平台的位置，与样本试验相比显著具有更低的保留延迟。比较组间每个试验的平均延迟时发现虽然样本延迟相似，但保留延迟不同，HFHC+PBS和 HFHC+LGG中的保留延迟显著高于NC和HFHC+AKK。这些结果显示，与L.rhamnosus GG等其他益生菌相比，A.muciniphila CIP107961作为益生菌治疗具有逆转受损空间工作记忆的功效。

图左 受NC、HFHC饮食和EE影响的不同组的肠道微生物评估

图右 受 PBS、LGG和AKK影响的实验组的体重和行为评估

5、Akk使脑代谢活动恢复正常

探索影响认知变化背后的大脑代谢活动时发现，HFHC+PBS组在前额叶皮层、背侧和腹侧纹状体、杏仁核（例如CeA、BLA、海马和PRh）中的CCO活性水平显著低于NC组。用A.muciniphila CIP107961治疗时，小鼠的大脑代谢活动与NC组在受HFHC影响前的大多数区域（例如前额叶皮层、背侧纹状体、杏仁核、海马和周围皮层）都相同，与HFHC+PBS相比HFHC+AKK的背侧纹状体、中央杏仁核和基底外侧杏仁核区域的CCO值增加。用L.rhamnosus GG治疗时，HFHC+LGG组在前额叶皮层、背侧和腹侧纹状体、丘脑核（如前内侧核、海马和周围皮层）中比NC组保持了较低的CCO水平，更重要的是，HFHC+PBS和HFHC+LGG在CCO 水平上没有显著差异。比较两种益生菌治疗时发现HFHC+AKK组在前额叶皮层和dST中CCO值显著高于HFHC+LGG组，这些结果表明，HFHC+PBS组的CCO值降低无法通过LGG给药恢复，而在AKK给药时出现了相反的效果，更重要的是，A.muciniphila CIP107961能够逆转先前受HFHC饮食影响的大多数大脑区域中与HFHC相关的CCO活性下降的趋势。

表左 受PBS、LGG和AKK影响的实验组的脑氧化代谢

图右 受NC、HFHC饮食和PBS、LGG和AKK影响的各组肠道微生物群分析

6、益生菌不会引起粪便微生物群的重大重排

MiSeq测序分析口服灌胃给药对灌胃喂养组（HFHC+AKK、HFHC+LGG和HFHC+PBS（对照组））肠道微生物群的影响，也包括NC组（无灌胃）作为外部对照。平均每个样本产生约63000个过滤的部分序列，并且NC组和其他三个NASH组之间在多样性和组成水平上存在最大差异，证实饮食具有强烈影响（对照与HFHC饮食），SCFA的分析遵循相同的趋势。比较两种益生菌对肠道微生物群的具体影响发现，与PBS给药相比，两种细菌的治疗导致微生物门组成发生独特变化，Bacteroidetes显著减少。应用LEfSe方法分析更细的分类水平发现只有少数科和属的丰度会因益生菌的治疗而发生不同的变化，LGG治疗显著增加Christensenellaceae、Ruminococcaceae、Peptococcaceae和Lactobacillus的相对丰度，HFHC+AKK组主要是Faecalibacterium、Prevotella 9和Ruminococcus UCG005的丰富更高。qPCR验证Lactobacillus和Akkermansia属浓度的变化发现，HFHC+LGG组Lactobacillus属的浓度更高，并且各组间Akkermansia属浓度没有差异。Chao1指数显示HFHC+AKK组比HFHC+PBS组具有更高的α多样性，而各组间Shannon’s index没有任何显著差异。这些结果表明益生菌可以影响微生物多样性，但它们不会引起粪便微生物群的重大重排。

图左 PBS、LGG 和 AKK 实验组的肠道微生物群探索

图右 受PBS、AKK和EE影响的HFHC小鼠的SCFA分析

这项实验说明微生物群和认知通过肠-脑轴密切相关，EE和AKK可以逆转HFHC引起的认知功能障碍，包括空间工作记忆受损和新物体识别。然而，AKK能恢复脑代谢活动，EE会导致整体下降。此外，AKK和LGG不会引起肠道微生物群的重大重排，细菌组成和多样性仅发生轻微变化，而EE导致Firmicutes和Verrucomicrobia成员增加。此外，该研究提出了干预策略，例如使用AKK治疗来管理与NASH相关的认知功能障碍。

1.在确立NASH药物治疗的常规临床应用前，应满足三个基本原则：

2.药物具有改善肝脏相关结局的临床疗效；

3.药物的总体安全性具有有利的风险-获益比；

3.与现行标准治疗相比，确定了药物治疗方法的成本效益。

未来AKK是否会用于NASH药物治疗？期待一下！

文章来源于“AKK Pro”公众号，欢迎订阅。

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